Прогресс в автоматизированном анализе мочи

Анализ мочи является основным диагностическим скрининговым тестом в клинической лаборатории, играющим важную роль в диагностике и мониторинге нефрологических и урологических заболеваний. До недавнего времени наиболее широко распространенным методом анализа мочи был микроскопический анализ осадка мочи. Однако эта трудоемкая методология связана с большими аналитическими ошибками. За последние 25 лет новые автоматизированные технологии и информатика значительно снизили трудоемкость анализа мочи и создали новые технические возможности. В этом обзоре представлены основные последние разработки в области автоматизированного анализа мочи и перспективы на будущее.

Микроскопический анализ осадка мочи остается ключевым методом анализа мочи; к сожалению, необходимые экспертные знания не всегда доступны в любое время (ночью, в выходные дни). Таким образом, электронная передача изображений (телемедицина) может быть очень полезна для получения диагностической информации, позволяя проводить консультации со специалистами по поводу необычных или сомнительных результатов и распространять интересные результаты среди медицинского и научного сообщества.

Хотя технология сухой химии для тест-полосок для мочи достигла ограниченного прогресса, достижения в области электронного обнаружения за последние годы значительно улучшили аналитическую чувствительность считывателей тест-полосок. В 2002 году Пендерс и др. продемонстрировали, что автоматическое считывание тест-полосок мочи позволяет количественно анализировать эритроциты (эритроциты), лейкоциты (лейкоциты), глюкозу и белок мочи. Согласно теории отражения, сформулированной Кубелкой и Мунк , обратное значение показаний отражения пропорционально концентрации измеряемого аналита. Применение этих количественных показаний тест-полосок было описано для кетонов и альбумина.

Классическая тест-полоска на альбумин, связывающая краситель, в сочетании с считывателем полосок на основе комплементарного оксида металла-полупроводника (КМОП) может позволить проводить количественный анализ альбуминурии и определение соотношения альбумин:креатинин. Данная разработка позволяет получать количественные показатели альбумина в диапазоне микроальбуминурии (20–200 мг/л). Тест-полоска, специфичная для креатинина, позволяет корректировать разбавление мочи, что полезно при оценке альбуминурии.

Используя технологию КМОП, можно также получить очень чувствительные показания активности лейкоцитарной эстеразы и пероксидазы. Как и в случае с альбуминурией, данные отражательной способности можно использовать для количественного анализа. Параллельно использование чувствительных красителей улучшило чувствительность тест-полосок на альбуминурию.

Интересной недавней эволюцией стало использование смартфонов для считывания и интерпретации результатов тест-полосок мочи . Были предложены мобильные платформы здравоохранения, сочетающие карманный колориметрический считыватель и коммерчески доступные 10-параметрические бумажные полоски для анализа мочи, способные отправлять данные через смартфон.

При ручной микроскопии несколько этапов, таких как центрифугирование, декантация и ресуспендирование, приводили к лизису и гибели клеток. Прогресс в области информатики и компьютерных технологий позволил разработать автоматизированную микроскопию, основанную на распознавании образов. За последние два десятилетия ряд производителей выпустили на рынок такие инструменты (таблица 1).

В отличие от большинства других автоматических анализаторов для микроскопии мочи, анализатор iQ200 (Iris Diagnostics, Чатсворт, Калифорния, США) использует технологию цифровой визуализации с ламинарным потоком. Его программное обеспечение для идентификации классифицирует и количественно определяет клетки и частицы в нецентрифугированной моче, используя одиночный ламинарный поток образца через объектив видеокамеры с заряженным соединительным устройством. Сотни снимков цифровой камеры оцениваются программным обеспечением для идентификации, и каждая частица классифицируется на основе таких характеристик, как форма, контраст и текстура. После классификации прибором оператор имеет возможность переклассифицировать или скорректировать полученные изображения в нужные категории. В различных исследованиях сообщается о сильной корреляции между выходными данными iQ200 и ручным подсчетом эритроцитов, лейкоцитов и эпителиальных клеток. Этот коэффициент корреляции составил 0,894 для эритроцитов, когда использовалось только программное обеспечение для распознавания частиц, и 0,948 для эритроцитов после повторной классификации на iQ200. В том же исследовании корреляция для лейкоцитов составила 0,885 (по сравнению с эталонным методом), а после повторной классификации она улучшилась до 0,978. Коэффициенты корреляции для выходных данных iQ200 после переклассификации пользователя составили 0,927 для плоских эпителиальных клеток, 0,856 для цилиндров и 0,706 для неплоских эпителиальных клеток. iQ200 демонстрирует хорошую линейность и точность, переноса не обнаружено. В некоторых случаях ложно повышенное количество эритроцитов может возникнуть из-за неправильной классификации дрожжей; то есть дрожжи можно спутать с эритроцитами. Кроме того, система не учитывает поврежденные лейкоциты и считает меньше эритроцитов, если присутствуют аномальные эритроциты, такие как призраки и дисморфные клетки. Результаты подсчета равны или превосходят результаты обычной светлопольной микроскопии или более ранней технологии проточной цитометрии. Прибор исключает ручную подготовку проб; однако для реклассификации результатов требуется хорошо обученный технолог. Оптическая система также позволяет количественно определять количество бактерий в моче. Из-за ограниченных возможностей классификационного программного обеспечения большинство проблем возникает при анализе микроорганизмов. Изображения мелких кокков, обнаруженных iQ200, медицинскому технологу сложно отнести к «бактериям». Лучшие результаты классификации получены для некоторых палочковидных форм. Кроме того, обнаружение злокачественных/атипичных уротелиальных клеток, которые могут указывать на диагноз карциномы мочевого пузыря, было достигнуто с помощью автоматизированной интеллектуальной микроскопии на iQ200 с чувствительностью идентификации 87,5%.

Аналогичный анализатор FUS-100 (Дируй, Чанчунь, Китай). Юксель и др. определили, что чувствительность FUS-100 для эритроцитов и лейкоцитов составляет 73% и 68% соответственно; однако было обнаружено, что соответствующий анализатор FUS-200 (Dirui) имеет неудовлетворительную аналитическую чувствительность к распознаванию и количественному определению бактерий.

sediMAX (77 Elektronika, Будапешт, Венгрия) — это автоматизированный анализатор осадка мочи на основе изображений, основанный на микроскопии (который в некоторых странах также известен как Urized). В то время как iQ200 делит идентифицированные частицы на разные категории (эритроциты и лейкоциты) [28], sediMAX отображает частицы во всех полях зрения, подобно микроскопическим полям, видимым при ручной микроскопии. Прибор обеспечивает как светлопольные, так и фазово-контрастные изображения, а также генерирует составное изображение из светлопольных и фазово-контрастных изображений, чтобы продемонстрировать особенности каждого изображения в одном представлении. Оценена его диагностическая эффективность с точки зрения визуальной фазоконтрастной микроскопии. Погрешность внутри анализа составила 17,8% и 6,7% при концентрации 18×106/л и 447×106/л соответственно для эритроцитов и 17% и 4,4% при концентрации 4×106/л и 258×106/л. L соответственно для WBC. Погрешность между экспериментами составила 14,7% при концентрации 30×106/л и 7,2% при концентрации 283×106/л для эритроцитов и 5,4% при концентрации 25×106/л и 3% при 166×106. /L для WBC. Площадь под кривой ROC (AUC) колебалась от 80% до 90% для эритроцитов, лейкоцитов, клеток плоского эпителия, дрожжей и кристаллов оксалата кальция. Для неплоских эпителиальных клеток, а также патологических и гиалиновых цилиндров AUC колебалась от 73% до 74%; переноса не обнаружено. Таким образом, sediMAX способен подсчитывать и идентифицировать эритроциты, лейкоциты, клетки плоского эпителия, дрожжи, бактерии и кристаллы оксалата кальция. Распознавание патологических цилиндров и неплоских эпителиальных клеток является достаточным, но требует улучшения.

Анализатор sediMAX второго поколения (sediMAX 2, 77 Elektronika) позволяет различать четыре типа кристаллов: дигидрат оксалата кальция, моногидрат оксалата кальция, мочевую кислоту и струвит. sediMAX conTRUST (77 Elektronika), анализатор sediMAX 2, обновленный фазово-контрастной микроскопией, может обнаруживать и другие кристаллы; однако он не может их точно идентифицировать, в результате чего программное обеспечение классифицирует их как неопознанные кристаллы. Различие между кристаллами мочи с использованием sediMAX conTRUST является специфическим, но недостаточно чувствительным. Кроме того, система пригодна для распознавания паразитов. Недавно на рынке были представлены автоматизированные анализаторы Cobas u701 (Roche Diagnostics, Мангейм, Германия) и Atellica 1500 (Siemens Healthineers, Эшборн, Германия). Эти анализаторы основаны на схожих принципах распознавания образов.

Проточные цитометры частиц мочи (UFC) имеют улучшенную точность и достоверность подсчета по сравнению с визуальной микроскопией и обеспечивают значительное сокращение трудозатрат. Первый такой UFC, UF-100 (Sysmex, Кобе, Япония), может идентифицировать эритроциты, лейкоциты, клетки плоского эпителия, переходные эпителиальные клетки и клетки почечных канальцев, бактерии, гиалиновые и инклюзивные цилиндры, дрожжеподобные клетки, кристаллы и сперматозоиды. , с использованием аргоновой лазерной проточной цитометрии. Аналитические и диагностические оценки продемонстрировали приемлемую линейность в клинически полезных рабочих диапазонах с погрешностью, которая последовательно и значительно меньше, чем у микроскопии, и с незначительным переносом. В исследованиях UFC сравнивались с подсчетом в камерах, количественной микроскопией мочи, подсчетом осадка, тест-полосками, бактериальной культурой и плотностью мочи. Клинические исследования с использованием UFC были сосредоточены на диагностике и мониторинге инфекций мочевыводящих путей; локализация участков гематурии; и диагностика, мониторинг и исключение заболеваний почек.

Классические аргоновые лазеры в УФЦ были заменены полупроводниковыми лазерами, которые имеют гораздо больший срок службы и, следовательно, более экономичны. Внедрение полупроводниковых лазеров (работающих на другой синей длине волны) заставило разработчиков полностью перепроектировать систему и адаптировать красители. Новые анализаторы UF-5000 и UF-4000 (Sysmex) способны распознавать, подсчитывать и классифицировать клетки путем анализа света прямого рассеяния (FSC), света бокового рассеяния (SSL), бокового флуоресцентного света (SFL) и деполяризованного бокового рассеяния света. свет (DSS). DSS был введен для улучшения чувствительности кристаллов и лучшего различия между эритроцитами и кристаллами; однако, в отличие от считывателей на основе микроскопии, дифференциация кристаллов невозможна.

Самый популярный подход заключается в сочетании тест-полосок с UFC для первичного скрининга либо с использованием обоих методов (т. е. UFC и полосок), либо с использованием тест-полосок для аналитов, не связанных с частицами, анализируемыми с помощью UFC. Поскольку было реализовано механическое соединение UFC и считывателей тест-полосок, теперь существуют экспертные системы, сочетающие оба метода тестирования на основе определяемых пользователем правил принятия решений. Реализация такой стратегии значительно сокращает обзор микроскопии и экономит время и деньги, не уменьшая клиническую полезность.

С помощью UF-1000i (Sysmex) методы прямого рассеяния бактерий (B_FSC) и рассеяния флуоресцентного света (B_FLH) можно использовать для предварительного распознавания инфекций мочевыводящих путей (ИМП), вызванных грамположительными или грамотрицательными бактериями. Оценка параметров B_FSC и B_FLH по гистограммам бактерий представляется полезной для различения грамотрицательных и грамположительных бактериальных штаммов. Данные B_FSC могут быть полезны для предположительного исключения ИМП, вызванных грамположительными бактериями.

Посев мочи считается золотым стандартом диагностики ИМВП. С его помощью можно определить уровень бактериурии и чувствительности к противомикробным препаратам. Однако не существует стандартизированного показателя бактериальной активности, указывающего на значительную бактериурию, применимого для всех типов ИМП. Научные данные, подтверждающие текущие рекомендации по посеву мочи, часто неполны, а в некоторых случаях рекомендации не указывают на четкий выбор.

Из-за высокого процента отрицательных результатов (до 60% в зависимости от условий ) существует необходимость в эффективном методе скрининга, сокращающем количество ненужных культуральных исследований. Было разработано несколько методов скрининга образцов с отрицательным посевом, включая химические тесты с тест-полосками (нитрит, лейкоцитарная эстераза, белок мочи и гемоглобин мочи) и ручное или автоматическое микроскопическое исследование осадка мочи (обнаружение частиц, лейкоцитов и микроорганизмов). . Хотя эти методы скрининга в основном используются в лабораториях общей практики и микробиологических лабораториях, они субъективны, требуют много времени, демонстрируют низкую чувствительность и отрицательную прогностическую ценность.

Многие авторы сообщили об использовании проточной цитометрии для обнаружения бактерий и лейкоцитов в образцах мочи. Проточная цитометрия может сократить количество культивируемых образцов, существенно снижая рабочую нагрузку, время и затраты, особенно в клинических лабораториях . Используя проточную цитометрию, отрицательные результаты можно было сообщить раньше, что существенно сократило ненужные эмпирические назначения антибиотиков. Использование проточной цитометрии позволяет сократить количество образцов мочи, обрабатываемых в клинической лаборатории, на 28–60%. Однако в литературе существуют большие различия в применяемых пороговых значениях, а также в чувствительности и специфичности полученных результатов. Эти различия в основном обусловлены спектром клинических состояний групп пациентов, участвующих в этих различных исследованиях. Эти различия можно объяснить разными определениями, используемыми для классификации ИМП, которые зависят от руководящих принципов, применяемых в конкретных условиях.
Таким образом, мы приходим к выводу, что применимость проточной цитометрии для скрининга отрицательных образцов мочи сильно зависит от характеристик популяции и определения отрицательного посева мочи. Кроме того, ограничением автоматизированных анализаторов мочи по сравнению с культуральными методами является то, что они подсчитывают как живые, так и мертвые бактериальные частицы, что дает более высокое количество частиц.

Для оптимизации лабораторного рабочего процесса были успешно механически интегрированы автоматические считыватели тест-полосок и анализаторы частиц. Помимо механической интеграции, развитие экспертных систем позволило сравнивать и выявлять случаи, требующие ручной проверки, что повышает качество результатов испытаний.

Поскольку погрешность анализа со временем может значительно возрасти, коррекция разведения мочи становится все более необходимой. Поскольку гидратация является основным фактором, влияющим на преаналитический анализ мочи, было введено множество эталонных параметров для оценки разведения и гидратации мочи. Наиболее часто используемыми эталонными аналитами являются определение удельного веса, проводимости и креатинина в моче. Измерение проводимости интегрировано в инструменты проточной цитометрии. Удельный вес можно измерить с помощью рефрактометрии или тест-полосок. В таблице 2 приведены наиболее важные параметры разведения, используемые при автоматическом анализе мочи.

Масс-спектрометрия (МС) MALDI-TOF недавно была внедрена в обычные лаборатории клинической микробиологии. Поскольку время, необходимое для посева, по-прежнему затрудняет принятие решений и рабочий процесс в лаборатории, определение характеристик бактериальной нагрузки непосредственно из образца представляет собой большой шаг вперед. В нескольких исследованиях изучался прямой анализ образцов мочи с использованием MALDI-TOF MS, что устраняло временную задержку, необходимую для идентификации патогена. Этот метод был предложен как быстрый и надежный метод идентификации бактерий.

Первоначальные исследования, сочетающие методы скрининга мочевых путей с прямым применением MALDI-TOF MS в образцах, положительных на бактериурию, продемонстрировали чувствительность прямой идентификации патогена в диапазоне от 67% до 86%. Эти результаты отражают результаты аналогичных исследований, показавших успешную идентификацию патогена из патоген-положительных культур крови.

Неясно, может ли MALDI-TOF MS удовлетворить требования диагностики ИМВП, учитывая необходимость скрининга для повышения выхода положительных образцов. Для прямого анализа мочи необходимы первоначальные этапы подготовки пробы для удаления клеточного мусора, лейкоцитов и слизи, а также для сбора бактерий. В текущей версии анализ результатов MALDI-TOF MS затруднен полимикробными образцами. До 77% катетер-ассоциированных ИМП являются полимикробными; поэтому необходимы улучшенные алгоритмы интерпретации спектров бактериальных комбинаций для тестирования этих образцов непосредственно из мочи . Кроме того, этот метод не дает достоверной информации о чувствительности к противомикробным препаратам, часто используемым при лечении ИМВП. Косвенные подходы к тестированию чувствительности к противомикробным препаратам находятся в стадии разработки и включают измерение побочных продуктов метаболизма бактерий в присутствии антибиотиков для оценки чувствительности.

Овианьо и др. разработали автоматизированный анализ на основе MALDI-TOF MS для быстрого и прямого обнаружения Enterobacteriaceae, продуцирующих карбапенемазы, в клинических образцах мочи в течение 90 минут после получения образца; активность карбапенемазы выявляют с помощью MALDI-TOF MS-анализа после надежной прямой идентификации грамотрицательных бацилл. В их исследовании бактерии были извлечены из образцов мочи, устойчивость к карбапенему была обнаружена с использованием имипенема в качестве маркера антибиотика, а результаты автоматически интерпретировались. Их анализ дал прямую надежную идентификацию в 91% образцов и показал 100% чувствительность и специфичность для обнаружения активности карбапенемазы в течение 90 минут после получения образца.

Ввиду большой потребности в разработке портативных и экономичных считывателей, карманные колориметрические считыватели могут быть объединены с измерительными щупами в устройстве, способном передавать цифровую информацию через смартфон, предлагая интегрированное решение для выявления заболеваний в области с ограниченным доступом к обученным экспертам. Достижения в области микрофлюидики позволили разработать новые методы анализа на основе чипов, которые в ближайшем будущем изменят область автоматического анализа мочи. Наряду с традиционными приложениями для анализа мочи интегрированные микрофлюидные чипы были описаны как многообещающий инструмент для измерения концентрации раковых клеток мочевого пузыря в образцах мочи. Аналогичным образом были разработаны и изготовлены микрофлюидные бумажные аналитические устройства для оценки бактерий, которые, как известно, вызывают ИМП (кишечная палочка) и заболевания, передающиеся половым путем (Neisseria gonorrhoeae), в образцах мочи человека .

За последние два десятилетия автоматизированный анализ мочи претерпел значительный технический прогресс. Приборы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии, дают надежные результаты, которые являются клинически полезными, а автоматическое считывание тест-полосок обеспечивает дополнительную ценность. Дополнительная интеграция существующих технологий может еще больше сократить время выполнения работ.

Тем временем объединение лабораторий привело к сокращению числа лабораторий и тем самым увеличило физическое расстояние между пациентом и лабораторией; эта тенденция создает серьезную преаналитическую проблему. Несмотря на улучшения в стандартизации, большинство ошибок при анализе мочи происходит вне аналитической фазы; в частности, гораздо более уязвимы преаналитические этапы. Поскольку аналитическая вариативность значительно сократилась, необходимо сосредоточить больше усилий на преаналитическом этапе.